Méthodes actuelles d’extraction d’acide nucléique

Méthodes actuelles d’extraction d’acide nucléique

PARTIE 1

L'extraction d'acide nucléique (NAE) est l'une des étapes les plus cruciales de la biologie moléculaire, étant couramment utilisée dans de nombreux domaines des sciences biologiques et médicales, car cette procédure marque un point de départ dans tout kit de diagnostic moléculaire [1].Cette procédure cruciale est connue depuis plus d’un siècle et s’est considérablement développée au cours des dernières décennies.Cependant, certains progrès doivent encore être réalisés pour que les protocoles NAE quittent les laboratoires pour entrer dans le « monde réel » du diagnostic sur le lieu d'intervention (POC-Dx).

De nos jours, on sait que les acides nucléiques (AN) intracellulaires peuvent être largement classés en génomiques (ou chromosomiques), plasmides et différents types d'ARN.Bien que les ARN possèdent de l'uracile tandis que les ADN contiennent de la thymine, les acides nucléiques présentent des propriétés biochimiques de base similaires mais peuvent avoir des structures tridimensionnelles assez distinctes (génomique, plasmide, ARNt, ARNm, ARNr, etc.).Cependant, malgré les différences structurelles, les méthodes les plus couramment utilisées décrites dans le présent texte peuvent être appliquées à l'ADN dans ses nombreux formats organisationnels (chromosomique, plasmide, etc.), ainsi qu'à l'ARN et ses formats multidimensionnels (ARNm, ARNr, ARNt). , miARN, etc.) avec des modifications mineures.

La NAE peut être grossièrement divisée en quatre étapes, qui peuvent être modulées en fonction de l’échantillon et des applications en aval : (i) perturbation cellulaire ;(ii) l'élimination des lipides membranaires, des protéines et d'autres acides nucléiques, (iii) la purification/liaison des acides nucléiques à partir de la masse ;et (iv) la concentration en acide nucléique.

La perturbation ou la désintégration cellulaire peut être obtenue par des méthodes physiques et/ou chimiques, dont l'objectif principal est de perturber la paroi cellulaire et/ou les membranes cellulaires.Les méthodes de perturbation sont principalement basées sur les propriétés de l'échantillon et, à cette fin, un large éventail d'outils et d'approches sont utilisés, seuls ou combinés, pour obtenir une perturbation des tissus/cellules.Les enzymes lytiques, les agents chaotropiques et différents types de détergents sont les principaux composants de la lyse chimique, tandis que la méthode mécanique perturbe les cellules par broyage, cisaillement, battage des billes et choc.Il est intéressant de noter que si une technique ne donne pas de bons résultats, une autre pourrait s’avérer efficace.Les méthodes de choc osmotique ont donné, dans certains cas, de meilleurs résultats que les protocoles courants de purification de NA tels que l'extraction au phénol-chloroforme et le battage de billes.Non seulement la perturbation cellulaire est importante pour l’extraction de l’ADN, mais elle joue également un rôle crucial dans l’industrie biopharmaceutique, car de nombreuses protéines recombinantes et autres constituants importants de la cellule peuvent être récupérés grâce à ce processus.Une autre approche pour la perturbation cellulaire consiste à utiliser différentes méthodes en combinaison.Un bon exemple est le cas de la lyse enzymatique, où de nombreux protocoles utilisent des protéases pour libérer la NA de son échafaudage protéique protecteur.En outre, l’inactivation des nucléases cellulaires libres en solution afin de protéger la nouvelle NA sans protéines est cruciale.Une combinaison de détergents et de sels chaotropiques dans une seule solution est utilisée pour solubiliser la paroi cellulaire et/ou la membrane cellulaire et inactiver les nucléases intracellulaires.La perturbation mécanique, quant à elle, utilise la force pour extraire les constituants de la cellule.Un exemple classique de broyage en biosciences est l’utilisation de mortier et de pilon, aujourd’hui optimisée par l’utilisation d’azote liquide (lorsque l’échantillon le permet).Les parois cellulaires peuvent également être perturbées par les ondes de choc créées par les changements rapides de pression provoqués par la sonication ou la cavitation.D'autres outils mécaniques disponibles pour la rupture cellulaire sont le cisaillement, qui utilise une force tangentielle pour percer un trou dans la cellule, et le battage de billes, qui utilise différentes billes de verre ou d'acier pour briser la paroi cellulaire résistante, comme mentionné..

Les méthodes NAE englobent l'extraction de l'ADN et de l'ARN, mais peuvent être plus largement caractérisées en méthodes chimiques ou en phase solide ;les deux contiennent les quatre étapes mentionnées ci-dessus.Dans les sections suivantes, nous passerons en revue le principe de fonctionnement et/ou la justification des principales méthodes utilisées aujourd’hui dans les sciences biologiques et médicales.Étant donné que les diagnostics moléculaires reposent largement sur des techniques commençant par la NAE, nous discuterons également de certaines des fonctionnalités de base des appareils disponibles pour POC-Dx, en culminant avec les défis et les limites de l'adaptation des méthodes NAE aux tests de diagnostic sur le lieu d'intervention.