La technologie de réaction en chaîne par polymérase (PCR) est un élément essentiel d'innombrables laboratoires de recherche et d'essais, dans de nombreux domaines, notamment la biomédecine, les diagnostics cliniques, les tests de microbiologie alimentaire et la criminalistique.Cette technologie fondamentale utilise le cycle thermique pour faciliter une série de réactions dans lesquelles un échantillon d’ADN est rapidement et exponentiellement répliqué pour produire des millions ou des milliards de copies de séquence.Lors de l'acquisition d'un nouveau système PCR, il est important de prendre en compte les objectifs finaux de votre application, la précision et l'efficacité de l'équipement de cycle thermique ainsi que la capacité et la flexibilité de l'instrument.Cet article donne un aperçu des différentes options et fonctionnalités disponibles pour les systèmes PCR afin de vous aider à affiner le système adapté à votre application.
1. PCR contre qPCR contre dPCR
Bien que tous les systèmes PCR répliquent l'ADN à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase, différentes méthodologies sont utilisées par différents systèmes pour obtenir des résultats spécifiques.Parmi ces différentes méthodes figurent la PCR standard, la PCR quantitative (qPCR) et la PCR numérique (dPCR).
Les machines PCR standard sont généralement utilisées pour amplifier l’ADN en vue de tests et d’utilisations ultérieurs en aval ;dans un sens, cette technologie est utilisée comme moyen de générer un produit final plutôt que comme méthode de test analytique elle-même.L'ADN amplifié ne peut être mesuré qu'une fois la réaction PCR terminée, plutôt qu'en temps réel, et c'est pourquoi cette méthode est parfois appelée PCR finale.Le produit final de l'amplification PCR traditionnelle est couramment utilisé pour le clonage et le séquençage en aval, et peut également être vérifié par électrophorèse sur gel pour confirmer la présence de séquences cibles et leur quantité relative à basse résolution (en fonction de l'intensité de la bande).
Pour une quantification plus rapide et plus précise de la quantité de séquence cible présente dans un échantillon, la PCR quantitative (qPCR), également connue sous le nom de PCR en temps réel, utilise des sondes fluorescentes pendant le processus d'amplification pour surveiller la quantité d'ADN présente après chaque cycle thermique.En observant combien de cycles sont nécessaires pour atteindre un certain seuil d'intensité de fluorescence, l'analyste peut déterminer la quantité d'ADN dans le matériau de départ en comparant les résultats à une courbe standard.La qPCR peut également confirmer la présence ou l'absence d'une séquence cible plus rapidement que la PCR finale et est donc utilisée dans des applications de diagnostic telles que la détection du SRAS-CoV-2 (en utilisant la transcription inverse pour convertir d'abord l'ARN viral en ADNc).
La PCR numérique (dPCR) est une autre méthode quantitative dans laquelle les réactions PCR ont lieu dans des milliers de chambres de réaction distinctes, et le nombre absolu de molécules d'ADN dans l'échantillon d'origine peut être déterminé en fonction du nombre de chambres de réaction produisant un signal fluorescent une fois l'amplification terminée. .Contrairement à la qPCR, les mesures de fluorescence ne sont pas effectuées en temps réel et aucune courbe étalon n’est nécessaire pour quantifier l’ADN présent dans l’échantillon.Bien que la dPCR ait généralement un débit limité et des coûts plus élevés que la qPCR, elle est plus précise, plus sensible et plus précise dans la quantification de l'ADN et est particulièrement utile dans des applications telles que la détection de mutations rares et de polymorphismes mononucléotidiques (SNP).
La décision de choisir une méthode PCR finale (qualitative/semi-quantitative) ou quantitative (qPCR ou dPCR) est relativement simple lorsque vous examinez votre application, mais le choix entre qPCR et dPCR peut être plus nuancé.La qPCR est à haut débit, rentable et suffisamment sensible pour de nombreuses applications, mais la dPCR peut être un meilleur choix si une quantification absolue avec de faibles limites de détection est primordiale.
2. L'importance du contrôle de la température
La capacité des thermocycleurs à ajuster et contrôler avec précision et efficacité la température des échantillons est ce qui permet le succès des réactions d’amplification et devrait être un objectif central lors de la sélection de tout système PCR.Différents systèmes peuvent offrir différentes capacités en ce qui concerne les taux de rampe, l'uniformité et la précision de la température, ainsi que la capacité d'obtenir des gradients de température entre les blocs thermiques pour faciliter l'optimisation de la méthode PCR.
Le taux de rampe fait référence à la vitesse des changements de température entre les étapes du cycle thermique et est généralement exprimé en degrés Celsius par seconde (°C/sec) dans les spécifications de l'instrument.Les fabricants peuvent fournir des informations sur les taux de rampe maximaux et les taux de rampe moyens, ainsi que faire la différence entre les taux de rampe ascendante (chauffage) et les taux de rampe descendante (refroidissement) d'un instrument.En général, des taux de rampe plus élevés correspondent à des durées d'exécution plus rapides, mais les acheteurs doivent se méfier de se concentrer sur les taux de rampe maximum sans examiner d'autres mesures liées à la vitesse de l'instrument.Un instrument ne peut atteindre sa vitesse de rampe la plus élevée que pendant une courte période, et la vitesse de rampe moyenne reflètera mieux le rythme des changements de température.Bien que les spécifications de taux de rampe puissent donner une idée générale de la vitesse à laquelle certains instruments peuvent fonctionner, lorsque cela est possible, recherchez des données sur les temps d'exécution réels démontrés sur un instrument pour obtenir une image réaliste de la manière dont des taux de rampe élevés se traduisent en analyses rapides.
La précision et l'uniformité de la température sont également essentielles au succès des réactions et, bien que tous les thermocycleurs soient conçus pour produire les températures nécessaires à la PCR, certaines fonctionnalités peuvent offrir un degré de confiance plus élevé, ce qui est essentiel pour les applications dans lesquelles les échantillons peuvent être limités et où les résultats sont fiables. primordial, comme dans le diagnostic clinique et la médecine légale.Un contrôle précis de la température est également crucial lors de l’utilisation de la machine PCR pour des techniques sensibles telles que l’analyse de fusion haute résolution (HRM).Un couvercle chauffant peut assurer une meilleure uniformité de température dans tout le tube PCR, car sans couvercle chauffant, l'échantillon peut s'évaporer et se condenser vers le haut du tube où la température est plus froide.La conception du bloc thermique a également un impact sur le contrôle de la température ;Les blocs d'aluminium sont l'option la plus économique mais sont les moins conducteurs, ce qui signifie qu'ils atteindront l'uniformité de la température plus lentement et auront des taux de rampe plus faibles que les blocs plus conducteurs.Les blocs recouverts d'argent et d'or sont plus chers mais permettent un transfert de chaleur plus rapide, garantissant une répartition uniforme de la température à travers le bloc.
Différentes cibles d'ADN peuvent nécessiter différentes températures pour obtenir les meilleurs résultats d'amplification ;par exemple, les séquences riches en GC nécessitent des températures plus élevées pour la dénaturation.Les températures de recuit idéales sont également influencées par une série de facteurs – alors que les températures pour cette étape sont généralement sélectionnées en fonction des températures de fusion des amorces, les différences de températures de fusion entre les paires d'amorces et l'influence de la concentration du réactif, du pH et de la concentration en sel peuvent tous font de l'optimisation des conditions de température de réaction une tâche compliquée. Les machines PCR dotées de capacités de gradient de température sont conçues pour aider à l'optimisation des méthodes PCR en permettant de tester plusieurs températures de recuit en une seule fois.En fonction des types et de la diversité des échantillons que vous envisagez d'analyser à l'aide de votre appareil PCR, le choix d'un instrument doté de capacités de gradient peut valoir le coût supplémentaire pour gagner beaucoup de temps et optimiser les nouveaux protocoles en moins d'analyses.
3. Blocs thermiques
Comme mentionné, le bloc thermique utilisé avec un instrument PCR peut faire une différence dans le contrôle de la température, mais la conception du bloc – et la conception de l'instrument pour accueillir différents blocs – a également un impact sur le débit, les coûts des consommables et la flexibilité.Les blocs typiques seront disponibles au format 96 puits ou 384 puits, bien que d'autres formats tels que 48 puits et 1 536 puits soient également disponibles.Un nombre de puits plus élevé permet un débit plus élevé avec des volumes de réaction plus faibles, ce qui sera initialement plus coûteux mais diminuera finalement le prix par réaction en raison du volume plus faible de réactif utilisé pour chaque puits.Le nombre d'échantillons que vous traiterez et la fréquence d'utilisation de la machine détermineront si un bloc thermique à nombre de puits inférieur ou supérieur sera le plus pratique et le plus rentable pour votre laboratoire.
Certains instruments sont livrés avec un format de bloc fixe tandis que d'autres permettent d'utiliser des blocs interchangeables, offrant plus de flexibilité pour basculer entre les formats de 96 et 384 puits ou entre différents matériaux de bloc pour différentes applications.Certains thermocycleurs peuvent également accueillir plusieurs blocs dans le même instrument, ce qui permet d'exécuter différents protocoles sur différents ensembles d'échantillons en même temps.3 Les blocs aux dimensions « universelles » améliorent encore la flexibilité pour utiliser des tubes, des bandelettes ou des plaques PCR de différentes tailles. comme requis.
En raison du rôle clé de ce composant dans le contrôle de la température, la manipulation des échantillons et le débit, les options de bloc thermique doivent être soigneusement prises en compte lors de la sélection d'un thermocycleur.Pour les laboratoires disposant d’un faible volume d’échantillons ou pour ceux qui n’exécutent régulièrement qu’une poignée d’analyses, des instruments à bloc fixe moins coûteux avec un format standard de 96 puits peuvent suffire.Cependant, les instruments modulaires et flexibles peuvent s'avérer avantageux pour les laboratoires disposant d'un plus grand nombre de protocoles, de volumes d'échantillons variables et d'un plus grand nombre d'utilisateurs s'appuyant sur le même instrument pour leurs propres analyses, ainsi que pour les laboratoires souhaitant augmenter leur capacité de production à l'avenir.
1. PCR contre qPCR contre dPCR
